Genetic improvement of frost resistance in autumn-sown white lupin through highthroughput phenotyping and genomic selection

White lupin is a cool-season grain legume that is gaining importance for European agriculture due to its high seed protein content and other positive characteristics. Autumn sowing has a rising interest in sub-oceanic and sub-continental climatic regions to extend the crop cycle and anticipate harvesting, thereby reducing the growing risk of terminal drought and enhancing yield potential. Despite the trend towards milder winters, frost remains a major threat, as sudden events can be detrimental, especially for poorly-acclimated plants. The increasing year-to-year climatic variability hinders the field selection for frost survival. The objective of this thesis is to support the genetic improvement of white lupin frost resistance by optimizing its evaluation under controlled conditions in a high-throughput phenotyping platform and exploring its prediction through genomic selection procedures. A methodological study was conducted to establish the experimental protocol and define the optimal screening temperature. Its results provided the foundation for a subsequent large-scale screening aimed at assessing the genetic variation for frost resistance in two reference populations, elucidating the trait genetic architecture, identifying putative candidate genes, assessing the potential of genomic selection through intra-population and inter-population predictive abilities of genome-enabled models, and quantifying the relative effects of frost resistance and other traits on field-based winter survival of a germplasm collection. The methodological study included 11 white lupin genotypes covering a broad range of winter survival, along with 11 pea genotypes. This material underwent four freezing treatments at -7, -9, -11, and -13 °C, arranged in a group-balanced block design with species in the main plots and different genotypes in subplots. In this and following work, frost resistance was assessed as plant mortality as well as by a 10-level visual score of biomass injury. The methodological study also enabled the estimation of genotype lethal temperature 50 (LT50). The large-scale screening involved two reference populations of white lupin, one comprising 144 landrace and cultivar genotypes and the other including 144 inbred lines, which were genotyped by 40,914 and 32,951 SNP markers, respectively, issued by genotyping-by-sequencing. This material was evaluated at -11 °C using an alpha-lattice design. A subset of 115 landraces and cultivars had also previously been evaluated for field-based winter mortality, onset of flowering, and seed dry weight. A freezing temperature of -11 °C was identified as the optimal treatment to maximise genotype frost resistance variation based on plant mortality in white lupin. Plant mortality and biomass injury at this temperature were highly correlated with LT50 values (0.94 and 0.91, respectively). On average, white lupin exhibited lower resistance than pea (LT50 = -11.0 °C vs. -12.8 °C). White lupin selection for frost resistance is favoured by high broad-sense heritability for plant mortality and biomass injury (H² = 0.76–0.82), substantial genetic variation across genotypes, and the identification of promising genetic resources. GWAS detected 11 significant markers linked to 21 candidate genes; however, multiple non-significant peaks, likely associated with minor genes, pointed out a polygenic control of frost resistance. Genomic selection achieved high predictive ability in the intra-population scenario when applied to the inbred lines (0.67–0.68), encouraging its adoption to reduce phenotyping efforts. In the inter-population scenario, model transferability was feasible only for the genetically broader model constructed from landrace and cultivar data for prediction of the genetically narrower inbred line material, but the moderate predictive ability (0.39) suggested that this strategy should be used only when the development of a population-specific model was prevented by lack of time or resources. In the field, winter survival of landraces and cultivars was largely achieved through frost escape via delayed onset of flowering, while the contribution of frost resistance became substantial when the comparison was restricted to intermediate-flowering material. A lower but significant contribution was found for higher seed dry weight (being reportedly associated with a thicker root parenchyma in young plants and enhanced root protection). Overall, this thesis (a) optimized the experimental protocol for large-scale frost resistance evaluation of white lupin in a phenotyping platform, (b) assessed the extent of genetic variation for white lupin frost resistance and identified elite genetic resources, (c) confirmed the polygenic control of frost resistance, (d) highlighted opportunities for genomic prediction in breeding line selection and in the identification of elite genetic resources, and (f) suggested that the simultaneous selection for intermediate phenology, frost and drought resistances, and seed size could be a viable strategy to develop autumn-sown varieties with high yield stability across years in Northern Italy and other regions with similar climatic characteristics.

Il lupino bianco è una leguminosa invernale che sta acquisendo importanza nell'agricoltura europea per il suo elevato contenuto proteico e altre caratteristiche qualitative dei semi. La semina autunnale ha un interesse crescente nelle regioni con clima sub-oceanico e sub-continentale, al fine di estendere il ciclo colturale e anticipare la raccolta, riducendo così il rischio crescente di siccità terminale e aumentando il potenziale produttivo. Nonostante la tendenza verso inverni più miti, le gelate rimangono una minaccia importante, poiché eventi improvvisi possono essere molto dannosi per piante scarsamente acclimatate al freddo. La crescente variabilità climatica tra anni ostacola la selezione in campo per la sopravvivenza al gelo. L'obiettivo di questa tesi è supportare il miglioramento genetico della resistenza al gelo di questa coltura, ottimizzandone la valutazione in condizioni controllate all’interno di una piattaforma di fenotipizzazione ad alto rendimento ed esplorando l’applicabilità della selezione genomica. È stato condotto uno studio metodologico per stabilire il protocollo sperimentale e definire la temperatura di valutazione ottimale. I suoi risultati hanno fornito le basi per un successivo screening su larga scala volto a definire la variazione genetica per la resistenza al gelo in due popolazioni di riferimento, studiare l'architettura genetica del carattere, identificare potenziali geni candidati, valutare il potenziale della selezione genomica attraverso il calcolo delle abilità predittive dei modelli di predizione intra-popolazione e inter-popolazione, e quantificare gli effetti relativi della resistenza al gelo e di altri caratteri sulla sopravvivenza invernale in campo. Lo studio metodologico ha incluso 11 genotipi di lupino bianco rappresentativi di un’ampia variabilità in termini di sopravvivenza invernale, insieme a 11 genotipi di pisello. Questo materiale è stato sottoposto a quattro trattamenti, ovvero −7, −9, −11 e −13 °C, organizzati secondo un disegno sperimentale a blocchi, con le specie nelle parcelle principali e i diversi genotipi nelle sotto-parcelle. In questo e nel lavoro successivo, la resistenza al gelo è stata valutata in base alla mortalità delle piante e ai danni alla biomassa, definiti tramite un punteggio visivo a 10 livelli. Lo studio metodologico ha inoltre consentito il calcolo della LT50, ovvero la temperatura corrispondente al 50% della mortalità di un certo genotipo. Lo screening su larga scala ha coinvolto due popolazioni di riferimento di lupino bianco: una comprendente 144 genotipi estratti da una collezione mondiale di ecotipi e cultivar e l'altra 144 linee di breeding, genotipizzate rispettivamente con 40.914 e 32.951 marcatori SNP ottenuti tramite genotyping-by-sequencing. Questo materiale è stato valutato a −11 °C utilizzando un disegno sperimentale alpha-lattice. Un sottoinsieme di 115 ecotipi e cultivar era stato precedentemente valutato anche per la mortalità invernale in campo, l'inizio della fioritura e il peso secco dei semi. Il trattamento a −11 °C è stato identificato come ottimale per massimizzare la variazione genotipica della resistenza al gelo per il lupino bianco, in base ai dati di mortalità. Mortalità e danno alla biomassa a questa temperatura sono risultati altamente correlati con i valori di LT50 (rispettivamente 0,94 e 0,91). In media, il lupino bianco ha mostrato una resistenza inferiore rispetto al pisello (LT50 = −11,0 °C vs. −12,8 °C). La selezione per resistenza al gelo in lupino bianco è risultata favorita dall'elevata ereditabilità (broad-sense heritability) per mortalità e danno alla biomassa (H² = 0,76–0,82), dall'ampia variazione genetica tra i genotipi e dall'identificazione di risorse genetiche resistenti. La GWAS ha rilevato 11 marcatori significativi collegati a 21 geni candidati. Tuttavia, numerosi picchi non significativi, probabilmente associati a geni con effetto minore, suggeriscono un controllo poligenico della resistenza al gelo. La selezione genomica ha raggiunto un'elevata capacità predittiva nello scenario intra-popolazione applicata alle linee di breeding (0,67–0,68), incoraggiandone l'uso, allo scopo di ridurre i costi e i tempi di fenotipizzazione. Nello scenario inter-popolazione, la trasferibilità del modello è risultata praticabile solo per il modello costruito sulla popolazione geneticamente più ampia (ecotipi e cultivar) per la predizione del materiale geneticamente più ristretto delle linee di breeding. Tuttavia, la moderata capacità predittiva (0,39) suggerisce che questa strategia dovrebbe essere impiegata solo quando lo sviluppo di un modello specifico per la popolazione sia impedito da mancanza di tempo o risorse. In campo, la sopravvivenza invernale di ecotipi e cultivar è stata raggiunta principalmente attraverso la strategia di frost-escape, basata sul ritardo nell'inizio della fioritura, mentre il contributo della resistenza al gelo è diventato sostanziale quando il confronto è stato limitato al materiale a fioritura intermedia. Un contributo minore ma significativo è stato riscontrato per un maggiore peso secco dei semi (associato, secondo la letteratura, a un parenchima radicale più spesso nelle piante giovani e quindi a una maggiore protezione dell'apparato radicale). Nel complesso, questo lavoro di te tesi ha: (a) ottimizzato il protocollo sperimentale per la valutazione su larga scala della resistenza al gelo del lupino bianco in condizioni controllate; (b) valutato l'entità della variazione genetica e identificato risorse genetiche resistenti; (c) confermato il controllo poligenico del carattere; (d) evidenziato il possibile uso della predizione genomica nella selezione di linee di breeding e nell'identificazione di risorse genetiche; e (f) suggerito che la selezione simultanea per fenologia intermedia, resistenza al gelo e alla siccità e dimensione del seme potrebbe rappresentare una strategia praticabile per sviluppare varietà a semina autunnale con elevata stabilità produttiva negli anni, per l’Italia settentrionale e altre regioni con caratteristiche climatiche simili.