Study and development of microbial cultures for the improvement of food quality and safety

This PhD thesis investigates the study and development of microbial cultures aimed at improving food quality and safety. Microorganisms play a central role in food fermentation processes, contributing not only to preservation and sensory enhancement, but also to the production of bioactive compounds with significant nutritional and health-promoting properties. However, their application also raises important safety concerns, particularly regarding the presence of antimicrobial resistance determinants and the potential production of harmful metabolites. The research is structured into three main experimental chapters addressing key aspects of microbial application in food systems. The first study focuses on the evaluation of folate production by lactic acid bacteria in fermented milk and during yogurt shelf life. Using an untargeted UHPLC-HRMS approach, the variability in folate vitamers among strains and over time was assessed, highlighting the potential of selected microorganisms to naturally biofortify dairy products with vitamin B9. The second study explores a safe-by-design strategy to enhance probiotic safety by removing antibiotic resistance genes. An endogenous CRISPR-based system was employed to successfully inactivate tetracycline resistance in Bifidobacterium animalis subsp. lactis. This work demonstrates the feasibility of genome editing approaches for improving the safety profile of probiotic strains while maintaining their functional properties. The third study investigates the development of innovative food matrices for probiotic delivery. Cinnamon-enriched chocolate pralines were designed as a non-dairy carrier for Lacticaseibacillus rhamnosus CRL1505. The results demonstrated that this matrix can support probiotic viability during storage and protect cells under simulated gastrointestinal conditions, suggesting its potential as an alternative functional food vehicle. Overall, this thesis highlights the multifaceted role of microorganisms as both functional and technological tools in the food industry. It underscores the importance of integrating microbial metabolism, safety assessment, and innovative delivery systems to develop next-generation functional foods. The findings contribute to advancing sustainable and health-oriented food production strategies, in line with current consumer demands and regulatory challenges.

Questa tesi di dottorato indaga lo studio e lo sviluppo di colture microbiche finalizzate al miglioramento della qualità e della sicurezza degli alimenti. I microrganismi svolgono un ruolo centrale nei processi di fermentazione, contribuendo non solo alla conservazione e al miglioramento delle caratteristiche sensoriali, ma anche alla produzione di composti bioattivi con rilevanti proprietà nutrizionali e salutistiche. Tuttavia, il loro impiego solleva importanti questioni di sicurezza, in particolare in relazione alla presenza di geni di resistenza agli antimicrobici e alla possibile produzione di metaboliti indesiderati. La ricerca è articolata in tre capitoli che affrontano aspetti chiave dell’applicazione dei microrganismi nei sistemi alimentari. Il primo studio è dedicato alla valutazione della produzione di folati da parte di batteri lattici in latte fermentato e durante la shelf life dello yogurt. Mediante un approccio untargeted UHPLC-HRMS, è stata analizzata la variabilità dei diversi vitameri del folato tra ceppi e nel tempo, evidenziando il potenziale di specifici microrganismi nel biofortificare naturalmente i prodotti lattiero-caseari con vitamina B9. Il secondo studio esplora una strategia safe-by-design per migliorare la sicurezza di batteri probiotici attraverso la rimozione di geni di resistenza agli antimicrobici. È stato utilizzato un sistema CRISPR endogeno per eliminare con successo la resistenza alla tetraciclina in Bifidobacterium animalis subsp. lactis. Questo lavoro dimostra la fattibilità di approcci di genome editing per migliorare il profilo di sicurezza dei ceppi probiotici mantenendone le proprietà funzionali. Inoltre, è stato dimostrato che il ceppo modificato non mostra reversione al fenotipo resistente alla tetraciclina. Il terzo studio riguarda lo sviluppo di matrici alimentari innovative per la veicolazione di probiotici. Praline di cioccolato arricchite con cannella sono state progettate come sistema alternativo di veicolazione per Lacticaseibacillus rhamnosus CRL1505. I risultati hanno evidenziato che questa matrice è in grado di supportare la vitalità dei probiotici durante la conservazione e di proteggerli in condizioni gastrointestinali simulate, suggerendo il suo potenziale come veicolo alternativo di alimenti funzionali. Nel complesso, questa tesi evidenzia il ruolo multifunzionale dei microrganismi come strumenti sia tecnologici sia funzionali nell’industria alimentare. Essa sottolinea l’importanza di integrare metabolismo microbico, valutazione della sicurezza e sviluppo di sistemi innovativi per la progettazione di alimenti funzionali di nuova generazione. I risultati contribuiscono al progresso di strategie di produzione alimentare sostenibili e orientate alla salute, in linea con le attuali esigenze dei consumatori e con le sfide normative.