Innovative Molecular and Analytical Approaches for the Safety Assessment of Plant-based Foods

This doctoral dissertation presents a multidisciplinary study aimed at the development, optimization, and validation of advanced analytical methodologies for the safety assessment of plant-based foods. The increasing diffusion of plant-derived food products, often characterized by complex formulations and innovative processing technologies, requires reliable and sensitive analytical tools capable of detecting and monitoring potential microbiological and chemical hazards throughout the food production chain. The research integrates molecular approaches, both qualitative and quantitative, and untargeted metabolomics methodologies to enable the detection, identification, and characterization of microorganisms and chemical contaminants in different plant-based food matrices. The first part of the study focuses on the application of third generation sequencing technologies (in particular, Oxford Nanopore Technology) for the detection and taxonomic characterization of spore-forming bacteria belonging to the genus Bacillus, with particular attention to the Bacillus cereus group, which represents a relevant microbiological hazard in plant-based food products. The sequencing approach allowed the identification of microbial communities present in different plant-based matrices and the evaluation of their distribution across commercial products. Subsequently, a Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay was developed and optimized for the detection of major toxin-encoding genes associated with the B. cereus group. The colorimetric LAMP protocol enabled a rapid detection of the target genes, representing a potential tool for rapid or decentralized analytical applications. In parallel, an absolute quantification strategy based on droplet digital PCR (ddPCR) was implemented to determine the copy number of B. cereus toxin genes in different categories of plant-based products. This approach provided accurate quantification of the genetic targets, contributing to improving microbiological risk assessment related to the presence of potentially toxigenic strains. The final part of the dissertation introduces an untargeted metabolomics approach based on UHPLC-ESI/QTOF-MS for the screening of chemical contaminants in plant-based foods, including pesticides, mycotoxins, and other potentially undesirable compounds originating from raw materials or processing steps. The developed methodologies were applied and validated on a wide range of commercial plant-based products belonging to different food categories, including plant-based beverages, meat analogues, and dietary supplements. The application of these analytical methods to real samples allowed the evaluation of their analytical performance and practical applicability under realistic conditions. Furthermore, selected methodologies were assessed through on-site validation activities conducted in collaboration with food companies and research institutions. Overall, the results demonstrate the potential of integrating advanced molecular techniques and metabolomics approaches to improve safety monitoring in plant-based foods and to support risk assessment strategies based on advanced analytical data.

Questa tesi di dottorato presenta uno studio multidisciplinare finalizzato allo sviluppo, all’ottimizzazione e alla validazione di metodologie analitiche avanzate per la valutazione della sicurezza degli alimenti plant-based. La crescente diffusione di prodotti alimentari di origine vegetale, spesso caratterizzati da formulazioni complesse e processi tecnologici innovativi, rende necessario sviluppare strumenti analitici affidabili e sensibili per l’identificazione e il monitoraggio di potenziali contaminanti microbiologici e chimici lungo l’intera filiera produttiva. Il lavoro integra approcci molecolari, sia qualitativi che quantitativi, e metodologie di metabolomica non target per la rilevazione, identificazione e caratterizzazione di microrganismi e contaminanti chimici in diverse matrici alimentari di origine vegetale. La prima parte della ricerca riguarda l’applicazione di tecnologie di sequenziamento di terza generazione (nello specifico, Oxford Nanopore Technology) per la rilevazione e la caratterizzazione tassonomica di batteri sporigeni appartenenti al genere Bacillus, con particolare attenzione al gruppo Bacillus cereus, riconosciuto come uno dei principali rischi microbiologici associati ai prodotti plant-based. L’approccio di sequenziamento ha consentito l’identificazione dei microrganismi presenti nelle matrici alimentari e la valutazione della loro distribuzione all’interno di diversi prodotti commerciali. Successivamente è stato sviluppato e ottimizzato un metodo basato sull’amplificazione isotermica mediata da loop (Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP) per la rilevazione dei principali geni di tossicità associati al gruppo B. cereus. Il protocollo colorimetrico sviluppato ha consentito una rilevazione rapida dei target genetici e presentando potenziali applicazioni per analisi rapide o decentralizzate. Parallelamente, è stato implementato un approccio di quantificazione assoluta mediante droplet digital PCR (ddPCR), finalizzato alla determinazione del numero di copie dei geni di tossicità di B. cereus in diverse categorie di prodotti plant-based. Questo approccio ha consentito di ottenere una quantificazione precisa dei target genetici, contribuendo a migliorare la valutazione del rischio microbiologico associato alla presenza di ceppi potenzialmente tossigeni. La parte finale della tesi introduce un approccio di metabolomica non target basato su UHPLC-ESI/QTOF-MS per lo screening di contaminanti chimici nei prodotti plant-based, inclusi pesticidi, micotossine e altri composti potenzialmente indesiderati derivanti da materie prime o processi produttivi. Le metodologie sviluppate sono state applicate e validate su un ampio set di prodotti commerciali plant-based appartenenti a diverse categorie merceologiche, tra cui bevande vegetali, analoghi della carne e integratori alimentari. L’applicazione delle metodologie su campioni reali ha consentito di valutarne le prestazioni analitiche e l’applicabilità in contesti realistici. Inoltre, alcune delle tecniche sviluppate sono state testate attraverso attività di validazione in situ presso aziende e centri di ricerca. Nel complesso, i risultati ottenuti evidenziano il potenziale dell’integrazione di tecniche molecolari avanzate e approcci metabolomici per migliorare il monitoraggio della sicurezza degli alimenti plant-based e supportare strategie di valutazione del rischio basate su dati analitici avanzati.