Aggiornamenti di Diagnostica Molecolare in Ematologia

Ai giorni nostri, una diagnostica avanzata delle neoplasie ematologiche non può prescindere dalla integrazione degli aspetti clinici, morfologici e immunofenotipici, con le alterazioni genetico-molecolari caratterizzate a livello di citogenetica, FISH e metodiche di biologia molecolare Per alcune neoplasie la mutazione di un singolo gene è predominante e definente la malattia, tuttavia nella stragrande maggioranza di casi è presente un pattern complesso di alterazioni genetiche con la maggiore frequenza di talune rispetto ad altre con la distinzione di mutazioni precoci driver, alterazioni tardive e mutazioni passeggere. In ambito ematologico sono state identificate aberrazioni genomiche clinicamente rilevanti con impatto diagnostico, prognostico, predittivo di risposta ad un determinato trattamento e come marcatori di malattia residua misurabile (MRD), che necessitano di essere identificate e riportate per ogni singolo paziente. I progressi tecnologici degli ultimi anni, soprattutto grazie alle metodiche di high-throughput sequencing, hanno cambiato la diagnostica molecolare muovendola da studi su singoli marcatori ad approcci più comprensivi con analisi di diversi geni contemporaneamente a livello di DNA e RNA. Ciò ha premesso di caratterizzare in maniera più approfondita il panorama genetico-molecolare delle neoplasie dei tessuti linfoide ed emopoietico ed ha contribuito alla revisione della loro classificazione nonché alla migliore definizione e distinzione di nuove e vecchie entità nosografiche. Le metodiche di high-throughput sequencing hanno affiancato le tecniche tradizionali PCR-based e variano dalla target-sequencing di un limitato numero di geni alla whole exome sequencing (WES), che analizza le regioni codificanti dei geni, o alla whole-genome sequencing (WGS), che analizza l’intero genoma. Queste metodiche hanno diversa capacità di rilevare aberrazioni somatiche, in quanto gli approcci target hanno una più alta profondità di sequenza e maggiore sensibilità nel rilevare alterazioni subclonali rispetto a tecnologie genome-wide in grado invece di identificare mutazioni caratterizzate da una maggiore frequenza allelica. Le metodiche di target sequencing possono studiare DNA o RNA ed avere pannelli basati o su ampliconi o sulla tecnica dell’hybridization capture. Quest’ultimi pannelli sono in grado di studiare simultanemente multiple variazioni di singoli nucleotidi (SNVs), inserzioni/delezioni (indels), aberrazioni di numero di copie (CNAs) e varanti strutturali come riarrangiamenti. Sono stati sviluppati pannelli capture-based “tutto in uno” che possono identificare le alterazioni genomiche più frequenti nell’ambito delle neoplasie linfoidi e mieloidi, di più facile applicazione routinaria della diagnostica molecolare. Le metodiche di Gene Expression Profiling (microarray) hanno contribuito ad indentificare, soprattutto nei linfomi, sottotipi biologicamente e prognosticamente distinti ed a studiare il microambiente tumorale. Sono stati sviluppati successivamente approcci target di più facile applicazione nella routine, come il Nanostring, la Reverse Transcriptase Multiplex Ligation–Dependent Probe Amplification (RT-MLPA) ed il Whole Transcriptome Sequencing.