ASSOCIATION BETWEEN FATTY ACIDS PROFILE AND GUT MICROBIOTA COMPOSITION IN ELDERLY PATIENTS WITH CHRONIC KIDNEY DISEASE

The aim of this thesis was to explore the possible associations between fatty acids (FA) profile and gut microbiota (gMb) with several conditions throughout the lifespan, from infancy to old age. In particular, we focused our attention on elderly subjects with Chronic Kidney Disease (CKD) and children with Acute Otitis Media (AOM). The terms “Chronic Kidney Disease” refers to several disorders with a progressive kidney function decline. International guidelines approved the definition of CKD as a condition with the presence of markers of kidney damage or with the estimated glomerular filtration rate (eGFR) less than 60 ml/min/1.73 m2 or both, for at least three months. End-stage renal disease is associated with a high cardiovascular disease (CVD) risk, the major cause of death in these patients. Chronic inflammation, oxidative stress, protein-energy wasting, disordered mineral metabolism, and deficiency of endogenous calcification inhibitors, known as non-traditional risks factor, take part in cardiovascular pathology in CKD. Inflammatory processes influence the physiological response to renal infection and injury but also participate in the development of potentially irreversible kidney damage with the production of various inflammatory molecular species, among whom eicosanoids and cytokines, from parental omega-6 long-chain polyunsaturated fatty acids (LCPUFA). Several studies focused their attention on the potential role of omega-3 (n-3) LCPUFA supplementation in subjects with CKD. Despite this, their effect on kidney damage is still not clear. However, it is widely agreed that a modified FA profile in CKD can determine a progression of the disease, inducing the inflammatory state. Moreover, high/normal n-3 LCPUFA levels decrease the risk of a decline of the disease. Omega-3 and omega-6 (n-6) LCPUFA concentrations and their ratios are tightly associated with renal health, because of their important roles in different pathways. Another aspect not very considered in the field of CKD is the role of circulating FA levels and their metabolites on the modulation of inflammation. The first aim of this study is to analyze the FA profile in elderly subjects with CKD. Blood samples have been collected from 57 subjects enrolled in the study, and FA analysis has been performed. During the last years, several studies underlined the strong relationship between intestinal inflammation and adverse outcomes in CKD. The health of gastrointestinal tract is fundamental to ensure the well being of the host contributing to its nutrition, metabolism, physiology, and immune function. The bacterial communities colonizing humans have been seen in terms of mutualistic symbiosis with their hosts, a mutually beneficial coexistence, playing an important role in health and disease. Abnormal colonization or changes in the gut microbial composition determine dysbiosis, a state associated with different illnesses, such as obesity, type 2 diabetes, inflammatory bowel disease, cardiovascular disease, and also chronic kidney disease. The relationship between gut and kidney is a bi-directional relation with a mutual influence. Chronic kidney disease influences gMB characteristics, especially through high levels of urea that easily spread in the intestinal fluid where bacterial urease enzymes degrade it, then it is hydrolyzed in ammonium hydroxide that increases fecal pH with a consequent alteration of intestinal cellular junctions. Besides, high levels of urea change intestinal microbiota composition damaging permeability of intestinal barrier and promoting proteolysis with production and absorption of uremic toxins, such as indoxyl sulfate (IS) and p-cresol sulfate (p-CS). These toxins induce an inflammatory process associated with CKD. Under physiologic conditions, the kidney through the urine eliminates these compounds, but CKD patients have a compromised renal clearance. Therefore, these solutes tend to accumulate in the organs. IS and p-CS are tightly bound to human serum albumin (HSA), the most abundant plasma protein in the bloodstream. HSA is recognized as the main means of transport for endogenous and exogenous compounds, including fatty acids that seem to be the main endogenous ligand of HSA, multiple binding sites are used for monounsaturated fatty acids (MUFA) and PUFA. Thus, free fatty acids and uremic toxins compete for the same binding sites on HSA. It is important to assess fatty acid (FA) levels in patients with CKD because of the potential role to contrast the accumulation of uremic toxins derived from the intestinal bacterial community. As a consequence of this bi-directional relation between gut and kidney and the possible involvement of some compounds as metabolites of FA in the inflammatory response, we investigate the correlation between circulating FA levels and the gMB composition in the same subjects with CKD, as the second aim of this thesis. 64 old CKD non-dialysis patients (eGFR 15-45 ml/min/1.73 m2) and 15 elderly subjects (>65 years) with normal renal function (eGFR >60 ml/min/1.73 m2, CKD-EPI) are enrolled. Bacterial composition was studied in a previous observational study by denaturating gel gradient electrophoresis (DGGE), high-throughput sequencing (16S ribosomal RNA), and quantitative real-time PCR (qPCR). This study described an increased abundance of some bacteria associated with pathological conditions. In agreement with the literature, the author found a reduced abundance of saccharolytic and butyrate-producing bacteria (Prevotella, Faecalibacterium prausnitzii, Roseburia) in CKD patients respect to the control group. Butyrate plays a crucial role in the maintenance of the gut barrier function. Taking that into account, we decided to investigate the correlation between gMB composition and FA profile in these subjects. The main result of the study was the significant positive correlation between Faecalibacterium prausnitzii and total n-3 levels, both associated with the antiinflammatory action. The present doctoral thesis underlines the need to perform further investigations in order to support evidence presented. Future studies may be useful to improve understanding of the effect of circulating fatty acids levels and their metabolites on gut microbial composition, inflammation process, and pathological conditions such as kidney disease. Our results showed that CKD patients with previous cardiovascular events had lower total and specific n-3 levels comparing with patients without them. Moreover, higher docosahexaenoic acid (DHA) levels and having had previous cardiovascular events seemed to have protective effects against further cardiovascular events. Moreover, we observed a significant reduction of the genera Roseburia and Faecalibacterium in CKD patients compared to C group and a significant lower abundance of F. prausnitzii and Roseburia spp. in CKD patients. Thus, our results seem in accordance with anti-inflammatory actions of total n-3, DHA, and saccharolytic and butyrateproducing bacteria. Many gMB changes seem to be related both to CKD and CVD. If the different gMB composition might play a causal role in cardiovascular events by an unbalanced production of some toxic substances, or if the gMB changes are merely a consequence of different dietary and lifestyle behaviours of these patients, it cannot be explained by the present study and all the yet available data. Further studies, possibly utilizing new high-throughput tools, will be required to understand the potential correlations between the gMB composition and other inflammation and oxidative stress markers in these patients. Other two studies have been performed during the doctoral course, to reach a better comprehension of fatty acids, gut microbial community and inflammatory states. A prospective pilot clinical study has been performed to to explore possible changes of gMB composition in children with AOM treated with amoxicillin with or without clavulanic acid. AOM is one of the most common bacterial infections in children and is normally treated with antibiotic therapies that lead to increasing antimicrobial resistance rates among otopathogens and may impair the correct development of the microbiota in early life. No significant differences were shown in the gMB composition of the overall cohort at different time intervals of the samples collection and in subjects treated with amoxicillin with or without clavulanic acid at different time intervals (T0, T1 and T2). A literature revision on lipids in infant formulae has been performed to better understanding quality and quality of dietary lipids because of their significant impact on health outcomes, especially when fat storing and/or absorption are limited (e.g., preterm birth and short bowel disease) or when fat byproducts may help to prevent some pathologies. The lipid composition of infant formulae varies according to the different fat sources used, and the potential biological effects are related to the variety of saturated and unsaturated FAs. Instead, ruminant-derived trans FAs and metabolites of n-3 LCPUFA with their anti-inflammatory properties can modulate immune function. Furthermore, dietary fats may influence the nutrient profile of formulae, improving the acceptance of these products and the compliance with dietary schedules. During the doctoral course, I spent a period abroad at Dell Pediatric Research Institute (DPRI), The University of Texas at Austin. In particular, I attended the laboratory of Doctor Brenna. I focused my research activity on a specific regulatory insertion-deletion polymorphism in the FADS gene cluster for better understanding its influence on PUFA and lipid profile.

Il termine malattia renale cronica (Chronic Kideny Disease: CKD) si riferisce a differenti condizioni caratterizzate da un progressivo declino della funzione renale. Le linee guida internazionali hanno definito la CKD come una condizione in cui siano presenti marcatori di danno renale e/o la velocità di filtrazione glomerulare stimata (Estimated Glomerular Filtration Rtae: eGFR) sia inferiore a 60 ml/min/1.73 m2 per almeno 3 mesi. L’insufficienza renale in stadio terminale è associata ad un alto rischio di malattia cardiovascolare (Cardiovascular Disease: CVD), la più frequente causa di morte in questi pazienti. Fattori di rischio “non-tradizionali” come: infiammazione cronica, stress ossidativo, deplezione proteico-energetica, disordini del metabolismo minerale e deficit di inibitori della calcificazione, partecipano alla patogenesi della CVD. L’infiammazione gioca un ruolo cruciale nella risposta fisiologica all’infezione e al danno renale e partecipa anche nell’evoluzione del danno renale irreversibile con la produzione di diverse molecole infiammatorie a partire da acidi grassi polinsaturi a lunga catena (Long Chain PolyuUsaturated Fatty Acids: LCPUFA) della serie Omega-6. La supplementazione di Omega-3, con effetto antinfiammatorio, nei pazienti affetti da CKD è stata ed è oggetto di molti studi, nonostante ciò, l’effetto sul danno renale è ancora poco chiaro. Comunque, è ampiamente riconosciuto che un alterato profilo lipidico possa determinare la progressione della patologia, inducendo lo stato infiammatorio. Inoltre, elevati/normali livelli di Omega-3 potrebbero essere associati al miglioramento della funzionalità renale, diminuendo quindi il rischio di peggioramento della malattia. Le concentrazioni e il rapporto di Omega-3 e Omega-6 sono strettamente associati alla salute del rene, poiché svolgono ruoli importanti in differenti vie metaboliche. Un altro aspetto, preso poco in considerazione, è l’effetto dei livelli di acidi grassi circolanti e dei loro metaboliti sullo stato infiammatorio e sulla sua modulazione. Il primo scopo di questo studio è stato quello di analizzare il profilo degli acidi grassi in soggetti anziani affetti da CKD. Sono stati arruolati 57 pazienti afferenti agli ambulatori di Nefrologia dell’Ospedale Maggiore Policlinico di Milano e sono stati raccolti campioni di sangue su cui è stata effettuata l’analisi del profilo lipidico. Negli ultimi anni, diversi studi hanno sottolineato la stretta associazione tra infiammazione a livello intestinale e peggioramento del quadro in pazienti con CKD. Il mantenimento di un ottimo stato del tratto gastrointestinale è fondamentale per assicurare lo stato di salute dell’ospite, contribuendo ai processi metabolici, fisiologici e immunologici. Le comunità batteriche instaurano un rapporto mutualistico con l’individuo che colonizzano, giocando un ruolo importante negli stati di salute e malattia. Un’anomala colonizzazione o cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale, determina disbiosi, uno squilibrio associato a diverse condizioni patologiche come obesità, diabete di tipo II, malattia intestinale cronica, CVD e anche CKD. Il rapporto tra intestino e rene è bidirezionale, nei pazienti affetti da malattia renale cronica, la composizione del microbiota intestinale risulta essere modificata rispetto a quella del soggetto sano. Alti livelli di urea che si riversano facilmente nel tratto intestinale modificano il microambiente chimico con conseguente innalzamento del pH del colon che esercita una pressione selettiva a favore di specie ureasi-positive, responsabili della conversione dell’urea in ammoniaca. Lo strato protettivo di muco viene degradato e la permeabilità della barriera intestinale viene compromessa. In conseguenza di ciò si ha il passaggio di materiale batterico attraverso la mucosa e l’attivazione di un meccanismo infiammatorio. Nei pazienti con funzionalità renale compromessa, il rene perde progressivamente la capacità di eliminare sia le sostanze provenienti dal metabolismo umano, sia quelle della comunità microbica intestinale. Alcune di queste sostanze sono rappresentate dalle tossine uremiche, tra quelle di derivazione intestinale le principali e più studiate sono p-cresil solfato (PCS) e indossile solfato (IS). IS e p-CS, strettamente legate all’albumina sierica (Human Serum Albumin: HSA), non vengono eliminate facilmente ma rimangono nel torrente ematico. HSA è la più abbondante proteina sierica ed è la principale trasportatrice di composti esogeni ed endogeni, inclusi gli acidi grassi che sembrano rappresentare il maggior ligando endogeno della proteina. Multipli siti di legame vengono utilizzati per gli acidi grassi monoinsaturi (MonoUnsaturated Fatty Acids: MUFA) e PUFA. Acidi grassi e tossine uremiche competono quindi per gli stessi siti di legame sulla proteina. Il potenziale ruolo degli acidi grassi nel contrastare l’accumulo di tossine uremiche derivate dalla comunità batterica intestinale ne giustifica l’importanza della valutazione dei loro livelli ematici. Secondo scopo di questa tesi di dottorato è stato quello di valutare la possibile correlazione tra i livelli di acidi grassi circolanti e la composizione del microbiota intestinale in soggetti affetti da CKD. Sono stati arruolati nello studio 64 pazienti anziani con CKD non dializzati e 15 soggetti anziani con normale funzionalità renale. La composizione del microbiota intestinale è stata precedentemente caratterizzata attraverso l’impiego delle tecniche di elezione: PCR-DGGE e la PCR quantitativa (qPCR). In accordo con la letteratura scientifica, è stata evidenziata una riduzione di batteri saccarolitici e produttori di butirrato nei pazienti con CKD rispetto al gruppo di controllo. Il butirrato sembra giocare un ruolo cruciale nel mantenimento delle ottimali condizioni della barriera intestinale. Tenendo ciò in considerazione è stato deciso di approfondire lo studio e valutare l’associazione tra la comunità microbica intestinale e i livelli di acidi grassi basali in tali pazienti. Come risultato più importante ottenuto, è stata osservata una correlazione positiva statisticamente significativa tra la specie batterica Faecalibacterium Prausnitzii e i livelli totali di Omega-3 entrambi associati a proprietà antinfiammatorie. La presente tesi di dottorato evidenzia la necessità di sostenere ulteriori ricerche per supportare i risultati qui presentati. Studi futuri potrebbero essere utili per migliorare la comprensione del ruolo degli acidi grassi circolanti e i loro metaboliti sulla composizione del microbiota intestinale, sullo stato infiammatorio e sulla malattia renale cronica.