GENOMIC INSIGHTS FOR SAFETY ASSESSMENT OF FOODBORNE BACTERIA

Safe food and the access to it is key to sustaining life and promoting good health. Unsafe food containing harmful microorganisms or chemical substances causes more than 200 diseases, ranging from diarrhoea to cancers that particularly affect infants, young children, elderly and immunocompromised individuals. The global burden of foodborne disease affects public health, society, and economy, therefore good collaboration between governments, producers and consumers is needed to help ensure food safety and stronger food systems. The most recent survey conducted by WHO (2015) showed an estimated 600 million ill individuals and 420 000 yearly deaths associated to unsafe food. The economic impact is mainly due to the lack of safe food in low and middle income causing a US$ 110 billion is lost each year in productivity and medical expenses. The main challenges to assure food safety remain tied to our food production and supply chain, where factors like environmental contamination, consumer preferences, timely detection and surveillance of outbreaks play a crucial role. Recently, DNA-based methodologies for microbial detection and investigation have sparked special interest, mainly linked to the development of sequencing technologies. Contrary to the traditional culture-dependent methods, DNA-based techniques such as Whole Genome Sequencing (WGS) that targets fast and sensitive results at a relative low price and short processing time. Moreover, WGS confers high discriminatory power that allows to determine important genomic characteristics linked to food safety like taxonomy, pathogenic potential, virulence and antimicrobial resistance and the genetic transfer thereof. The understanding of these characteristics is fundamental to design detection and mitigation strategies to apply along the entire food-chain following a ‘One Health’ perspective, leading to gain knowledge about the microbiota that affect humans, animals, and environment. The aim of the thesis is to gain insight into the genomics of foodborne microbes for their characterization and to create or improve strategies for their detection and mitigation methods. Particularly, this thesis is focused on the assessment of the pathogenic potential based on genomic analyses including taxonomy, virulence, antibiotic resistance and mobilome studies. The second focus is to profit from the genomic insights to design rapid and time-effective detection devices and reliable mitigation methods to tackle foodborne pathogens. In more detail the following topics will be handled: The presence of multi-drug resistant strains in ready-to-eat fermented food represents a risk of public health for the spread of AMR determinants in the food chain and in the gut microbiota of consumers. Genomic analyses permitted to accurately assess the safety of E. faecium strain UC7251, with respect to its virulence and co-location of antibiotic and heavy metal resistance genes in mobile elements with conjugation capacity in different matrices. This work emphasizes the importance of a surveillance for the presence of AMR bacteria in food and to incite the development of innovative strategies for the mitigation of the risk related to antimicrobial resistance diffusion in food. The accuracy of taxonomic identification drives the subsequent analysis and, for this reason, a suitable method to identify species is crucial. The species re-classification of Enterococcus faecium clade B was investigated, using a combined approach of phylogenomics, multilocus sequence typing, average nucleotide identity and digital DNA–DNA hybridization. The goal is to show how the genome analysis is more effective and give more detailed results concerning the species definition, respect to the analysis of the 16S rRNA sequence. This led to the proposal to reclassify all the E. faecium clade B as E. lactis, recognizing the two groups are phylogenetically separate, where a specific safety assessment procedure can be designed, before their use in food or as probiotics, including the consideration for inclusion in the European QPS list. From this taxonomic re-classification, we developed a PCR-based method for rapid detection and differentiation of these two species and to discuss main phenotypic and genotypic differences from a clinical perspective. To this aim, core-genome alignment base on pangenome analysis was used. Allelic difference between certain core genes allowed primer design and species identification through PCR with 100% specificity and no cross-reactivity. Moreover, clinical E. lactis genomes categorised as a potential risk due to the ability of enhanced bacterial translocation. Antimicrobial agents alternative to antibiotics are one of the main areas of development and improvement in the current food chain. Metallic nanoparticles like Platinum nanoparticles (PtNPs), have awaken interest due to their potent catalytic activities similar to oxidases and peroxidases granting strong antimicrobial effects, have been proposed as potential candidates to overcome the drawbacks of antibiotics like drug resistance. The goal is to study the mode of action of PtNPs related to biofilm formation capacity, reactive oxygen species (ROS) coping mechanism and quorum sensing using foodborne bacteria like Enterococcus faecium and Salmonella Typhimurium.

La sicurezza alimentare e l'accesso ad essa sono fondamentali per sostenere la vita e promuovere una buona salute. Gli alimenti non sicuri, contenenti microrganismi o sostanze chimiche nocive, sono causa di oltre 200 malattie, dalla diarrea al cancro, che colpiscono in particolare i neonati, i bambini piccoli, gli anziani e gli individui immunocompromessi. L'onere globale delle malattie di origine alimentare si ripercuote sulla salute pubblica, sulla società e sull'economia, pertanto è necessaria una buona collaborazione tra governi, produttori e consumatori per contribuire a garantire la sicurezza alimentare e sistemi alimentari più solidi. L'indagine più recente condotta dall'OMS (2015) ha evidenziato una stima di 600 milioni di individui malati e 420.000 decessi annui associati ad alimenti non sicuri. L'impatto economico è dovuto principalmente alla mancanza di alimenti sicuri nei Paesi a basso e medio reddito, con una perdita di 110 miliardi di dollari l'anno in termini di produttività e spese mediche. Le sfide principali per garantire la sicurezza alimentare rimangono legate alla nostra produzione alimentare e alla catena di approvvigionamento, dove fattori come la contaminazione ambientale, le preferenze dei consumatori, il rilevamento tempestivo e la sorveglianza dei focolai giocano un ruolo cruciale. Recentemente, le metodologie basate sul DNA per il rilevamento e l'indagine microbica hanno suscitato particolare interesse, soprattutto grazie allo sviluppo delle tecnologie di sequenziamento. Contrariamente ai metodi tradizionali dipendenti dalla coltura, le tecniche basate sul DNA, come il sequenziamento dell'intero genoma (WGS), mirano a risultati rapidi e sensibili a un prezzo relativamente basso e a tempi di elaborazione brevi. Inoltre, il WGS conferisce un elevato potere discriminatorio che consente di determinare importanti caratteristiche genomiche legate alla sicurezza alimentare, come la tassonomia, il potenziale patogeno, la virulenza e la resistenza antimicrobica e il relativo trasferimento genetico. La comprensione di queste caratteristiche è fondamentale per progettare strategie di rilevamento e mitigazione da applicare lungo l'intera catena alimentare secondo una prospettiva di "One Health", che porta ad acquisire conoscenze sul microbiota che influenza l'uomo, gli animali e l'ambiente. Lo scopo della tesi è quello di approfondire la genomica dei microbi di origine alimentare per la loro caratterizzazione e per creare o migliorare le strategie per la loro individuazione e i metodi di mitigazione. In particolare, questa tesi si concentra sulla valutazione del potenziale patogeno sulla base di analisi genomiche che includono studi di tassonomia, virulenza, resistenza agli antibiotici e mobiloma. Il secondo obiettivo è quello di trarre vantaggio dalle conoscenze genomiche per progettare dispositivi di rilevamento rapidi ed efficaci e metodi di mitigazione affidabili per affrontare i patogeni di origine alimentare. Più in dettaglio, saranno trattati i seguenti argomenti: La presenza di ceppi multiresistenti negli alimenti fermentati pronti al consumo rappresenta un rischio per la salute pubblica per la diffusione di determinanti AMR nella catena alimentare e nel microbiota intestinale dei consumatori. Le analisi genomiche hanno permesso di valutare accuratamente la sicurezza del ceppo UC7251 di E. faecium, in relazione alla sua virulenza e alla co-localizzazione dei geni di resistenza agli antibiotici e ai metalli pesanti in elementi mobili con capacità di coniugazione in diverse matrici. Questo lavoro sottolinea l'importanza di una sorveglianza della presenza di batteri AMR negli alimenti e di incitare lo sviluppo di strategie innovative per la mitigazione del rischio legato alla diffusione della resistenza antimicrobica negli alimenti. L'accuratezza dell'identificazione tassonomica guida le analisi successive e, per questo motivo, un metodo adeguato per identificare le specie è fondamentale. È stata studiata la riclassificazione delle specie di Enterococcus faecium clade B, utilizzando un approccio combinato di filogenomica, tipizzazione di sequenza multilocus, identità nucleotidica media e ibridazione digitale DNA-DNA. L'obiettivo è dimostrare come l'analisi del genoma sia più efficace e fornisca risultati più dettagliati riguardo alla definizione delle specie, rispetto all'analisi della sequenza del 16S rRNA. Ciò ha portato alla proposta di riclassificare tutto il clade B di E. faecium come E. lactis, riconoscendo che i due gruppi sono filogeneticamente separati, per cui è possibile definire una specifica procedura di valutazione della sicurezza, prima del loro utilizzo negli alimenti o come probiotici, compresa la considerazione per l'inclusione nella lista europea QPS. A partire da questa riclassificazione tassonomica, abbiamo sviluppato un metodo basato sulla PCR per la rapida individuazione e differenziazione di queste due specie e per discutere le principali differenze fenotipiche e genotipiche da una prospettiva clinica. A questo scopo, è stato utilizzato un allineamento del core-genoma basato sull'analisi del pangenoma. La differenza allelica tra alcuni geni del core ha permesso la progettazione di primer e l'identificazione della specie mediante PCR con una specificità del 100% e senza reattività crociata. Inoltre, i genomi clinici di E. lactis sono stati classificati come un rischio potenziale a causa della capacità di aumentare la traslocazione batterica. Gli agenti antimicrobici alternativi agli antibiotici sono una delle principali aree di sviluppo e miglioramento dell'attuale catena alimentare. Le nanoparticelle metalliche, come le nanoparticelle di platino (PtNPs), hanno suscitato interesse per le loro potenti attività catalitiche simili alle ossidasi e alle perossidasi che garantiscono forti effetti antimicrobici, e sono state proposte come potenziali candidati per superare gli inconvenienti degli antibiotici come la resistenza ai farmaci. L'obiettivo è studiare la modalità d'azione delle PtNPs in relazione alla capacità di formazione del biofilm, al meccanismo di contrasto delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) e al quorum sensing utilizzando batteri di origine alimentare come Enterococcus faecium e Salmonella Typhimurium.